一场突如其来的新冠疫情，让大家重视日常防护的同时，也让「核酸检测」一词变得耳熟能详。疫情爆发时，全员进行核酸检测，不仅见证了中国速度，更为及时遏制疫情蔓延，主动防控风险提供了重要保障。

核酸检测主要是利用实时荧光定量 PCR（qPCR）技术，对样本中的基因组进行扩增检测，以判断样本是否受到新冠病毒感染。其实，除了用于新冠病毒检测，qPCR 技术在细胞治疗药物的质量控制中也发挥着重要的作用。


Microsart^® ATMP 真菌检测试剂盒是一款采用 qPCR 方法进行真菌快速检测的试剂盒，是实验室进行细胞培养液、生物制品等真菌污染检测的理想之选。


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近年来，肿瘤的发病率居高不下，细胞治疗和干细胞药物的蓬勃发展，为肿瘤治疗带来了新的曙光。细胞治疗是从病人体中分离出某些特定功能的细胞，在体外经过扩增、培养和生物工程改造后，产生具有增强功能的细胞，能够精准的识别病变组织和细胞，回输到病人体内后，实现治疗疾病的目的。


 

鉴于分离改造的细胞需要重新回输到病人体内，因此，样品是否受到微生物污染对细胞治疗产品的品质和病人的生命安全至关重要。

传统的微生物检测是通过对供试样品进行培养以判断是否受到污染。这种方法通常耗时久，比如利用培养法进行支原体检测，由于支原体生长缓慢，需要 28 天才能得到检测结果；无菌检测通常也需要经过 14 天的连续培养和观察。此外，对操作人员的专业技能要求较高，操作不当或评判经验不足，可能导致假阳性或假阴性的结果，从而造成病人健康受到威胁，甚至面临死亡的风险。

随着分子生物学技术的发展，PCR（聚合酶链式反应）技术得到长足的发展。PCR 是一种用于扩增特定 DNA 片段的技术，又称为体外 DNA 扩增。模板 DNA 经加热，双链结构会解螺旋形成单链。

引物与单链 DNA 的碱基序列特异性配对结合，在 Taq DNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为原料，通过半保留复制原理，合成一条与模板 DNA 互补的拷贝。随后在低温下，两条单链 DNA 复性形成双链。每经过一轮扩增，DNA 分子增加一倍，2～3 个小时目的基因可扩增几百万倍。

在细菌和真菌的基因组中存在一段高度保守的 DNA 序列（细菌中为 16S rRNA，真菌为 18S rRNA），该序列用于编码 rRNA，存在于所有的微生物中，可以用作微生物检测和鉴定。借助 PCR 手段，针对 16S rRNA 和 18S rRNA 设计特异性引物，可以把细胞治疗药物给药前的微生物检测时间从数周缩短至 3 个小时，大大提高检测的效率，确保病人用药的安全性。

实时荧光定量 PCR（qPCR）是在传统 PCR 的基础上，将荧光集团加入到 PCR 反应体系中，借助于荧光信号的积累对整个 PCR 过程进行监控，通过标准曲线即可对未知模板进行定量分析。qPCR 无需在扩增后通过琼脂糖凝胶电泳对起始模板进行检测，而是通过反应过程中荧光信号的变化进行判断。因此准确性更高，而且可以对样本进行定量分析。

目前主流的 qPCR 方法分为染料法和探针法两种:

染料法是在 PCR 体系中加入 SYBR Green 的染料，该染料在游离状态不发光。随着 PCR 的扩增，染料可以与 dsDNA 双螺旋小沟区域相结合而激发荧光。但是由于 SYBR Green 染料可以无差别的与所有双链 DNA 结合发荧光，因而特异性较差，需要在扩增结束之后，通过溶解曲线来评判 PCR 扩增产物是否单一。

与染料法不同，探针法是在 PCR 体系中额外加入特异性的 TaqMan^® 探针。TaqMan^® 探针是一段与目的基因特异性结合的寡核苷酸序列，其 5』 末端带有 FAM、TET、VIC 等荧光基团，3』 端带有 TAMRA、BHQ 等荧光淬灭集团，在游离状态下，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收而不发荧光。随着 PCR 扩增的进行，Taq DNA 聚合酶的 5』 - 3』 外切酶活性将 TaqMan^® 探针的核苷键切断，荧光基团游离出来而发出荧光。由于每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的积累与 PCR 产物的形成完全同步，因此使用探针法进行检测的特异性高，重复性好，更适合关键病原微生物的检测和监控。

目前，qPCR 已应用于细胞治疗产品给药前微生物快速质控检测。为了确保治疗用药的安全性，确保病人生命健康。应选择灵敏度高，特异性强的 TaqMan^® 探针法，以避免由于非特异性扩增导致的假阳性风险。

此外，PCR 反应易受到反应条件和样品的抑制而造成假阴性的风险。因此，在 PCR 体系中加入内参基因（Internal Control），通过内参基因能否正常扩增来评判 PCR 体系是否正常，以规避由于假阴性引起的病人感染、甚至死亡等医疗风险，确保药品疗效的同时全面保障病人的健康安全。