分子垂钓是生命科学研究中的常用手段，简单来说就是从一个分子库里（比如某个细胞裂解液的粗样品）钓取可以与已知生物分子相结合的配体分子。一般先将这个已知分子偶联在固相上面，然后和细胞裂解液里的物质结合，最终将洗脱下样品交由质谱进行鉴定。

一个成功的垂钓实验会涉及到几个重要因素

1. 将已知分子牢固地偶联到固相上，并保持其生物活性；

2. 尽量减少混合样品和固相之间的非特异性结合；

3. 确保洗脱的物质有足够的量来做质谱（浓度尽可能高，避免浓缩处理导致的损耗）；

4. 对垂钓鉴定结果进行验证。应用经纯化的样品，再次通过分子互作技术进行表征鉴定。

目前最常用的垂钓方法是Pull-Down，但是其缺点是非特异性高，操作麻烦。现在基于生物层干涉技术（BLI）的Octet分子互作仪器以及传感器，针对这几个问题进行了积极的优化和改进，成为做分子垂钓的新方法。

今天陈老湿给大家介绍一篇文章，来自于意大利国家研究委员会下属的生物结构和生物成像研究所的。他们在研究中发现了针对某一肿瘤标志物的抗体，并成功应用BLI技术垂钓和鉴定出这个抗体的表位（抗体结合位点）【1】。

 

来自意大利科学家的BLI垂钓案例经典技术路线

Preferentially Expressed Antigen in Melanoma (PRAME，黑色素瘤特异性抗原) 是重要的肿瘤标志物和治疗靶点。科学家通过研究，发现了针对这个抗原的高亲和力抗体。接下来的工作就是希望通过分子垂钓技术，对该抗体的识别表位开展鉴定工作。

下图是做表位垂钓和鉴定的技术路线

1. 先用BLI鉴定抗体与抗原结合。用胺基偶联传感器固化抗体，通过与抗原进行结合解离得到的数据，确认该抗体与抗原的结合亲和力较高；

2. 将抗原用胰蛋白酶消化成多肽，并用质谱开展鉴定。通过同蛋白序列的分析对比，发现这些多肽序列的覆盖率很高，从而确认抗原预处理是成功的；

3. 应用Octet AR2G（胺基偶联传感器）固化抗体，抓取抗原消化产物，并用质谱开展鉴定；

4. 对鉴定得到的能与抗体结合的多肽序列进行人工合成，并标记上生物素标签；

5. 采用Octet互作分析仪，用链霉亲和素（SA）传感器固化生物素化多肽，与抗体结合解离，鉴定多肽与抗体的亲和力。

由此可见，Octet不仅可以作为整个抗原和表位多肽的亲和力鉴定手段，同样也是用于垂钓表位多肽的工具，两全其美！

 

BLI垂钓方法的关键技术点

作者将几微升1μM浓度的抗原进行消化后，将其与固化了抗体的AR2G传感器在试管中孵育3分钟。随后用PBS缓冲液洗涤1分钟，最后用0.1%的TFA洗脱（该洗脱液可以兼容质谱）。重复该过程10次以确保积累足够多的洗脱产物。

 

 

BLI垂钓的质谱鉴定结果：除去一些角蛋白的污染物多肽（K2,K3,K4）外，有一个PRAME（202-212）相关的多肽片段。

通过BLI技术发现并确认了PRAME与抗体的潜在表位位置在202-212！另外，陈老湿必须提醒大家，在质谱鉴定垂钓产物中，角蛋白相关多肽作为污染物被发现的概率非常高。因为这个蛋白大量存在于皮肤毛发中，所以其作为污染物可能在EP管等各种溶液容器中普遍存在，请大家在做实验的时候尽量注意这点。

BLI的传感器还有一个优点就是可以和PCR管完美配合。只要在PCR管里加入10ul左右的样品或者洗脱液，并将传感器直接插入试管，就可以轻松完成垂钓。

 

用BLI进一步对垂钓产物进行鉴定

潜在位点毕竟是潜在位点，垂钓毕竟是垂钓，对这个多肽与抗体的结合进行进一步鉴定是必不可少的。这个基于BLI技术的非标记技术和直接结合（direct binding）又可以大显身手了。BLI技术可直接对两个生物分子之间进行实时的相互作用检测，尽可能大地保证结果的真实性。同时实时监测的结果能够为研究者展示相互作用的过程，得到Kon、Koff、KD等重要的动力学表征参数。Octet系统凭借测试速度快，步骤少，自动化程度高，数据重复性好，结果准确率高等优点，已成为当前市场上最主要的分子互作工具之一。

 

垂钓产物的鉴定：将生物素化PRAME（202-212）固化在链霉亲和素传感器上，与抗体的有明显结合（A图），而PRAME（202-212）的 突变体与抗体没有明显结合（B图）

 

 

应用Octet开展分子垂钓的优势

1. 提供多种传感器固化已知分子

2. 可以到达到ng级以上的洗脱量（如果传感器上结合量够大，做SDS-PAGE都够，请看这里），并实现微量洗脱

3. 提供较低非特异性吸附的基质

4. 通过直接结合实验来验证鉴定垂钓产物

5. 易于操作，实验成本低
 

还犹豫什么呢，
赶紧用Octet来试试分子垂钓吧！

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-参考文献-
【1】Development of a New Highly Selective Monoclonal Antibody against Preferentially Expressed Antigen in Melanoma (PRAME) and Identification of the Target Epitope by Bio-Layer Interferometry. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3166. https://doi.org/10.3390/ ijms22063166