上一期，陈老师为大家介绍了活细胞分析在免疫学中的十大应用（其中前五个重点应用）；今天书接上文，我们一起来看看Incucyte®在免疫学研究中的另外五大应用：

1. 吞噬作用和细胞清除

2. 细胞增殖及计数

3. 细胞鉴定和免疫分型

4. 细胞激活和分

5. 细胞健康和凋亡

6. 免疫细胞杀伤（细胞溶解）

7. NETosis

8. 趋化作用

9. 病毒感染

10. 抗体内化

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吞噬作用和细胞清除

吞噬作用是一种特殊形式的细胞内吞作用，可将微生物病原体和外来的、垂死的细胞灭活并从体内清除。评估吞噬作用的常用方法通常为单点分析（例如高内涵分析），需要细胞分离（例如流式细胞术）或清洗/淬灭标记病原体（例如荧光素标记）。

Incucyte®则大大简化了分析流程。使用pH值敏感染料（如pHrodo®）标记活细胞，使该标签与细菌壁蛋白或目标细胞连接。当蛋白或目标细胞被吞噬并进入吞噬体的酸性环境时，可以测量染料荧光随时间的增强。这种方法能够区分吞噬作用和非特异性的细胞吸收或表面结合的非内化标签，提高检测准确性。

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NETosis

NETosis是一种独特的细胞程序性死亡的形式，也是机体防御感染机制之一。当中性粒细胞遇到入侵的病原体时，它们会释放出一种抗菌蛋白和染色质的混合物来捕获和降解微生物。

Incucyte®可结合 Incucyte® Cytotox 绿色试剂实时自动定量分析执行 NETosis 过程的中性粒细胞的膨胀和解聚阶段，以及之后的 NET 释放过程。实时数据分析也有助于确定补充生化分析的最佳时间点，如NETs中细胞外骨髓氧化酶（MPO）的存在（Gupta, et al., 2017）。此文章总结说，活细胞分析是 "评估中性粒细胞生理学和NETosis、以及迅速开发和测试新的中性粒细胞靶标的有力工具"。

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趋化作用

趋化作用是细胞在化学刺激下的定向运动，是免疫反应的一个重要组成部分。中性粒细胞、单核细胞、T细胞、巨噬细胞和小胶质细胞都会以这种方式被吸引到病原体和炎症刺激物上。Incucyte® Clearview 96孔趋化板每个孔中都有精确的激光钻孔供细胞移动通过。与传统的Boyden Chamber实验不同的是，当细胞向化学试剂移动时，可以对其进行可视化，量化动力学，能够更深入地洞察细胞随时间的全部生理特征和形态变化。另一个好处是，仅需传统方法1/5~1/10的细胞数量，且重复性更好。

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病毒感染 

在体外测量病毒在哺乳动物细胞中的感染性和复制能力对于我们了解病毒感染疾病、筛选新的抗病毒药物和疫苗以及免疫细胞佐剂至关重要。与传统的蚀斑实验和病灶形成实验相比，Incucyte®可以通过计算被荧光蛋白（如GFP）标记的病毒的细胞数量和程度来自动量化病毒的传播和复制能力，同时还可以评估病毒滴度。此外，HD图像和实时拍摄还提供了病毒侵染后的细胞凋亡或坏死等相关数据。

Incucyte®活细胞分析工作流程的一个有趣的优点是，当添加病毒或病毒复制体到细胞后，培养板不需要离开培养箱。因此，即使是高度传染性的病毒也可以在适当的生物隔离设施中安全地进行分析，而不会使操作者暴露在潜在的危险中。

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抗体内化

单克隆抗体（mAb）和抗体偶联药物（ADCs）被广泛用于靶向免疫细胞，特别是在肿瘤免疫学和自身免疫性疾病中。这些生物制剂的一个关键特性是内化到不同细胞中的程度和速度决定了它们的疗效、安全性和药效曲线。

传统方法先对每种抗体进行费时费力的标记，过程中需要洗涤步骤，且只能进行单一时间点的分析。整个操作过程繁杂、细胞易损失、数据遗漏。因此，在整个抗体筛选和功能表征过程中，迫切需要一种高效简便的方法，在活细胞状态下进行实时分析快速地定量抗体内化水平。

Incucyte®可以直接在96孔板中检测Ab内化。使用对pH值敏感的荧光染料（Incucyte® Fabfluor-pH）直接与Ab的Fc段结合，即可检测Ab进入细胞内随酸性条件的增强，荧光信号增反映其内化的过程。只需一步添加染料，无需洗涤，即可实现抗体内化的快速、动力学、高通量分析。同一表面蛋白的不同Abs具有不同的内化特征，通过实时活细胞分析可在生物药筛选和优化的关键步骤中，准确且高效地比较不同的抗体候选药物及生产批次的内化率。

说一千，道一万。实时、活的、动态过程，高通量，这就是Incucyte®！

陈老湿彷佛看到了Octet®的身影~分子水平+细胞水平，神仙组合~