牛IgG具有高达70个氨基酸的超长CDR-H3结构域。之前发现，具有牛的CDR-H3的HIV中和抗体会识别gp120 CD4结合位点上的表位，该表位通常凹陷于常规抗体。所以超长CDR-H3抗体可能会识别一些人抗体无法识别的隐蔽表位，并扩大抗体识别的靶点区域[1]。

 

应用案例

德国默克（Merck）的科学家们设计了基于牛CDR-H3双特异性抗体，靶向肿瘤细胞上的表皮生长因子受体（EGFR）以及自然杀伤（NK）细胞上的天然细胞毒性受体NKp30。基于牛IgG的双特异性抗体（BsAbs）引发了有效的NK细胞重定向，从而引发了EGFR过表达的肿瘤细胞裂解以及促炎细胞因子的强劲释放[2]。


 

牛源CDR-H3双特异性抗体的产生示意图。通过牛抗体文库筛选出针对两个靶标（以红色和黄色显示）的识别序列。嫁接到人源Fab支架上，利用重链异源二聚技术（例如SEED技术）组装成双特异性抗体。
 

主要技术路线
 

 

 

Octet®高通量筛选高亲和力双特异性抗体

Octet®基于生物层干涉技术（BLI），是被美国药典认可的用于亲和力检测的标准方法。Octet®具有高通量和易使用等特点，成为生物医药企业必备工具之一。在Merck的这个方案中，Octet®被选择作为抗体亲和力检测的主要方法。
 

Octet® Red 96，用Anti-human Fc传感器固化抗体，分别与EGFR（左图），NKp30（中图）进行结合解离检测其亲和力。然后通过连续结合两个靶点，观察抗体是否可以同时结合两个抗原（右图）。
 

用Octet®检测的亲和力结果列表（部分）




iQue®高通量流式检测细胞水平结合

科研人员使用iQue® 3高通量流式细胞仪评估细胞结合，并使用仪器配套智能软件ForeCyt®进行分析。iQue®高通量流式具有检测速度快，样品耗量少等特点，是细胞水平高通量筛选的常用仪器。
 

左图为EGFR高表达的A431细胞与双特异抗体结合：每孔测量800-1800个A431细胞。在两个初始洗涤步骤后，将细胞和100 nM的bsAbs孵育，洗涤后加入荧光标记的Goat Anti-Human IgG和碘化丙啶（标记死细胞）。可见，bsAbs可以和A431细胞结合。

右图为双特异抗体与NKp30结合：检测双特异性抗体是否可以同时结合两个靶点，在bsAb以100 nM的浓度与A431细胞孵育和洗涤后，与His标签的NKp30孵育30分钟。再将细胞与抗His抗体和碘化丙啶孵育。可见，bsAbs可以同时结合A431细胞和NKp30。



Incucyte®实时监测杀伤效果

对于免疫细胞杀伤实验，Incucyte®实时活细胞分析系统可以在不移动细胞培养板的情况下，对细胞状态进行实时荧光拍摄，不需要对细胞进行悬浮处理，并且具备高通量特性，可同时放置6块96或384孔板。
 

A431细胞深红色染料染色。将靶细胞以20 μL体积以2500个细胞/孔接种到384孔透明底部微量滴定板中，并孵育3小时。以不同的E：T比（即1:1，5:1，10:1和20:1）加入NK细胞，再加入不同浓度的BsAbs。用绿色凋亡染料进行死活细胞染色，然后在Incucyte®系统中进行实时在线测量24小时。计算红绿叠加面积为裂解率。用西妥昔单抗触发的最大裂解率或用30 μM星孢菌素培养的靶细胞进行normalization。

可见，活性最佳的几个BsAbs显示出nM级的EC50杀伤效果（A图），接近于100%的最大杀伤率（B,C图）



赛多利斯生物分析部门始终致力于智能、可靠的高通量药物表征及筛选方法的开发。无论在药物研发还是在基础研究中，生物分析三剑客—Octet®分子互作分析系统、iQue®高通量流式细胞仪和Incucyte®实时活细胞分析系统，都能够分别从分子互作水平、细胞互作水平和细胞成像水平中提供更高效，更便捷的解决方案，让大家在竞争激烈的市场中占有一席之地！


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-参考文献-

Structural Basis of Broad HIV Neutralization by a Vaccine-Induced Cow Antibody. Sci Adv (2020) 6:eaba0468. doi: 10.1126/sciadv.aba0468

Grabbing the Bull by Both Horns: Bovine Ultralong CDR-H3 Paratopes Enable Engineering of 'Almost Natural' Common Light Chain Bispecific Antibodies Suitable For Effector Cell Redirection. Frontiers in Immunology, 01 Jan 2021, 12:801368