相比于2D细胞模型，类器官能够更真实地反映和模拟体内真实的生理和病理环境。发展至今，类器官在精准医疗、药物发现、再生医学及疾病建模等多个研究领域表现出了巨大的应用潜力。尽管很多应用还处于早期开发阶段，但类器官为疾病研究提供新的机会，并为现有的细胞系和动物模型提供重要补充。
 

类器官应用

 

 

 

类器官培养与分析的痛点

包括美国菌种保藏中心（ATCC）在内的多个组织和研究机构发布许多针对多种类器官培养的protocol，定义了其培养条件、接种密度、基质建议和其他关键参数。但是对类器官的定量分析面临重重挑战：

- 每个孔中类器官形成的重复性无法保证，缺少成熟的实验方案

- 检测和数据通量低

- 费时耗力，需要手动操作获取类器官图像

- 需要借助第三方软件做分析——定量信息有限

- 图像采集过程中的环境控制不到位，导致结果可信度不高

赛多利斯Incucyte®实时活细胞分析系统可谓应时而生。

- 专有的明场（BF）图像采集能够可视化、定量化地监测类器官在Matrigel® domes中形成和生长的动力学；

- 通过自动绘制类器官尺寸、计数和形态随时间变化的图谱，提供关于分化和成熟的定量数据；

- 置于培养箱中直接进行分析，避免类器官所需生理环境被干扰。

 

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Incucyte®实时活细胞分析系统

 

 

三个步骤
“一加、二拍、三分析”
 

Incucyte® 分析Matrigel® domes培养类器官的实验流程。能够轻松培养、扩增和维护类器官培养物，反映相应器官的生理学。

 

四大应用
 

1. 类器官生长

2. 类器官培养条件

3. 类器官成熟阶段

4. 类器官分化及生长效率

Incucyte®类器官分析简单实用，一学就会！


应用1：监测并量化类器官生长

应用亮点：Incucyte®能够在长达数天、数周甚至数月的时间内，对多种组织样本进行定量分析。检测过程发生在稳定的培养箱环境中，避免来回取放培养板对类器官生长造成的影响。

使用Incucyte®及类器官分析软件对生长于Matrigel® dome培养的三种不同类器官的生长情况进行监测（图1，左：肠道类器官；中：胰腺类器官；右：肝脏类器官）。顶行显示了接种后6天后三种不同类型类器官的单一对焦BF二维图像；中间行为顶行方框内放大后的图像，显示了细胞类型的具体形态特征。底行显示了单个孔中BF区域面积（μm2）随时间的变化，证明了特定细胞类型的类器官生长。成熟的肝脏和胰腺类器官表现出相似的大小和快速生长能力，而肠道类器官则显得较小，并在成熟时表现出明显的发芽形态。
 

图1. 在Matrigel® Dome中捕获和量化三种不同类器官的生长。将小鼠肠道（1:3传代，50% Matrigel®）、胰腺（1:5传代，100% Matrigel®）和肝脏类器官（1:40传代，100% Matrigel®）嵌入24孔板的Matrigel® Dome中，并在Incucyte®系统中每6小时用4倍镜采集一次图像。每个数据点代表均值±SEM，n=4个孔。



应用2：优化类器官培养条件

应用亮点：Incucyte®能够实时、连续地监测类器官形成的动力学数据，捕捉细胞形态变化，从而客观地评估生长条件和接种密度的影响，并确定扩增所需的条件。

使用Incucyte®筛选小鼠肝脏类器官的理想培养条件。首先将小鼠肝脏类器官以多种密度接种到Matrigel® Dome中，通过Incucyte®软件自动对其尺寸和计数进行分析。接种5天后获取的BF图像和时间曲线（图2）。结果显示类器官大小和生长率与细胞数量成正比。以最高密度接种的类器官较大（直径>500 μm），并表现出快速生长的特点，在120小时达到最大尺寸。而在较低的密度下，类器官的成熟阶段延长，且具有最大的生长潜力（平均面积时程曲线）。
 

图2. 确定类器官扩增的最优条件将小鼠肝脏器官嵌入Matrigel® Dome（100%），在48孔板中以多种密度接种。接种后五天获取BF图像。每隔6小时收集数据，总计168小时。4倍镜拍摄所有图像。每个数据点代表均值±SEM，n=14个孔。



应用3：鉴定类器官最佳成熟阶段

应用亮点：Incucyte® 能够实时、定量分析类器官偏心率、暗度等细胞形态的变化，快速、精确地评估最佳培养传代周期，为下游实验打好基础。

为了确定嵌入Matrigel® Dome中的小鼠肝脏类器官的最佳传代频率，使用Incucyte®对培养物进行了8天的图像采集（图3）。通常情况下，肝脏类器官在达到最大生长限并且没有萎陷时就可以进行传代。BF图像显示，接种两天后，大多数类器官的直径小于100 μm，并且有清晰的腔隙，不适合传代。随后48小时内观察到偏心率的下降（见最右侧时间曲线），类器官接近圆形。该培养物传代的最佳时期发生在第4天和第5天之间，此时Dome内的大多数类器官已达到最大尺寸，呈圆形且没有萎陷。第6天的图像和时间曲线表明，达到最大尺寸的类器官已经萎陷且变暗。
 

图3：使用综合形态定义特定细胞类型的传代频率。将肝脏类器官嵌入24孔板中的100% Matrigel® Dome（1:10传代）。每隔6小时收集数据，总计192小时。4倍镜拍摄所有图像。每个数据点代表均值±SEM，n=6个孔。



应用4：实时监测类器官分化及生长效率

应用亮点：Incucyte®长时间连续成像和分析的能力能够对类器官扩增提供可靠、可重复的评估。通过类器官软件能够动态、客观地量化多个参数，更高效且简便地评估延长传代期时类器官的扩增和生长效率。

在此案例中，当传代密度保持一致时，随着时间的推移，肠道类器官表现出重复性较高的计数、面积、偏心率和暗度值。此外，接种后第7天的BF图像证实了对明确出芽表型的维持状态。
 

图4. 评估多次传代的类器官生长和分化效率。将肠道类器官嵌入50%的Matrigel® Dome（1:3传代，24孔板），经过多次传代，确定其随着时间推移的生长和分化一致性。每隔6小时收集数据，总计192小时。4倍镜拍摄所有图像。每个数据点代表均值±SEM，n=6个孔。

 

Summary
Incucyte® 实时活细胞分析系统，结合Incucyte®类器官分析软件可促进对类器官形成和生长过程动态、定性、准确的评价，使类器官培养与分析不再困难。

 

文末彩蛋
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赛多利斯电子书《类器官与药物发现》，汇总了3D类器官模型在肿瘤学、新药发现、转化医学等研究的学习资源，总结并介绍了实时活细胞分析技术在3D细胞及类器官培养研究中的实验操作及应用案例。
 

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-参考文献-

Sato T, Vries RG, Snippert HJ, van de Wetering M, Barker N, Stange DE, van Es JH, Abo A, Kujala P, Peters PJ, Clevers H. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature 459: 262–265, 2009.