新冠病毒的肆虐引发了对疫苗的迫切需要，疫苗研发从常规的8~10年缩短至1~2年，对加速整个疫苗研发及工艺流程提出了新的技术要求。作为疫苗研发的神器，Octet®分子互作分析系统在新冠疫苗研发中大显神威，知名的几个新冠疫苗研发过程中都有它的身影，而且Octet®采用的生物层干涉（BLI）技术也是美国药典中用于结合活性和定量检测的标准方法[1]，能够从以下几个方面加速疫苗研发：

疫苗的快速浓度测定

疫苗的结合活性研究

疫苗效果评价和机制研究

残留物测试



疫苗浓度的快速测定

将针对疫苗的受体或抗体固化在传感器上，然后快速检测疫苗效价（浓度），整个实验可以在10分钟内完成，检测浓度范围在0.1 - 1000 ug/mL，覆盖疫苗生产过程中的浓度范围，样品往往不需要稀释。目前BLI技术广泛用于HPV以及流感等疫苗的浓度测定，非常适合疫苗生产的中间过程以及成品快速QC。
 

生物膜层干涉技术的对疫苗浓度测定过程（以流感疫苗为例）[2]
 

 

只需要四步：

1. 将能够结合病毒的受体或者抗体固化在传感器上（比如唾液酸糖是流感病毒的受体），1-3分钟；

2. 用样品的基质平衡， 1-2分钟；

3. 结合含有分析物的样品，2-5分钟；

4. 分析：根据结合曲线的起始斜率计算样品浓度。
 

左：流感疫苗不同浓度下的结合曲线
右：流感疫苗的浓度与信号的标准曲线
 

某疫苗生产企业用BLI技术（蓝色）和ELISA（红色）检测发酵上清中某型HPV疫苗，对比发现，两者的结果非常接近，并且BLI速度较快，所以BLI技术已替代ELISA用于HPV疫苗生产中间控制。



新冠疫苗结合活性研究

基于重组蛋白或者mRNA的新冠疫苗一般是Spike蛋白结构域，与受体ACE2的结合活性可反映其构象的正确性，是产生中和抗体的前提。Octet®在测结合活性方面具备更多优势：

实时非标记，直接检测疫苗和受体的结合，没有洗涤步骤的干扰

测试速度快，一般10分钟内结束

可以计算结合速率常数和解离速率常数，对结合活性更加定量化

与其他技术相比，无流路，操作简便，通量高，维护简单，耗材便宜

Novavax公司的NVX-CoV2373是一种新冠纳米颗粒疫苗，由三聚体的全长的SARS-CoV-2的S蛋白和Matrix-M1佐剂组成，已获批上市。S1/S2亚基剪切位点682-RRAR-685突变到682-QQAQ-685，以及位于CH的986/987位氨基酸残基突变成了脯氨酸。Octet®检测该疫苗与ACE2的结合是非常强的，解离明显慢于野生型S蛋白[3]。
 

NTA传感器固化ACE2，与不同浓度的野生型S蛋白以及疫苗NVX-CoV2373结合

全球第一个上市的mRNA新冠疫苗BNT162b2（辉瑞&BioNTech），也使用Octet®检测其表达产物与ACE2的亲和力（nM级别），并且和已知中和抗体B38也有结合[4]，说明其维持了中和抗体表位。所以，Octet®可以通过检测结合活性来对mRNA疫苗的基因序列进行筛选。
 

Octet ® RED384系统，用SA传感器固化avitag的ACE2-PD，用proG传感器固化抗体，与不同浓度的P2 S（疫苗表达产物）检测亲和力，两者的亲和力在nM级别。
 

疫苗评价——
血清中抗体效价的确定

针对疫苗的免疫血清的效价测试也是判断疫苗免疫原性的重要指标。一般将疫苗固化在传感器上，直接检测不同稀释度的免疫动物/人血清，快速检测血清中抗体的效价，并可以通过计算解离常数或者结合信号获知抗体的结合能力。传统方法只能获得效价，而无法获得抗体的结合能力。Octet®可以在1个小时内完成80份血清样品的检测。
 

不同RSV F蛋白构造体用不同佐剂免疫动物后的血清效价，结合信号越高说明血清效价越高[5]。


疫苗评价——
保护性抗原表位检测

通过检测疫苗与一系列已知表位的中和抗体的亲和力，获知疫苗是否保持了正确的构象，并判断诱导中和抗体表位的能力。主要用于亚单位疫苗和VLP疫苗。
 

基于RSV F蛋白的疫苗构造体与已知结合表位的抗体的亲和力测定，选择尽可能与所有中和抗体结合的疫苗构造体[6]。


疫苗诱导的中和抗体评估

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新冠疫苗第三针有用吗？几千个Octet数据告诉你


疫苗研发中残留物的测试

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Octet® Anti-CHO HCP Kit | Sartorius


Webinar

作为成熟的分析方法，Octet®已协助包括新冠疫苗在内的多种疫苗的研究和开发，应用于多个关键环节，包括表位设计、识别及特征分析，病原体多样性和分布，抗体亲和力测定，宿主免疫反应特征、多样性和分布，核酸和分子病原体-宿主相互作用研究，以及治疗药物及临床研究等。

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Summary

- BLI法利用疫苗的结合速率，可快速测定疫苗效力或者产量

- 直接检测粗样品，适合检测亚单位（蛋白，多糖）疫苗，灭活或者减活病毒疫苗的生产过程中间控制

- 宽广的线性检测范围，大多数样品不需要稀释，或者稀释倍数较低，尽可能减少稀释带来的误差

- 全自动且步骤少，可以保证良好的重复性

- 基于结合动力学的检测更直接，结果更准确

- 可以信号放大，从而检测HCP等残留物

-参考文献-

2021版美国药典，通则， 通则

Universal label-free In-process Quantification of Influenza Virus-like particles[J]. Biotechnology Journal, 2017:1700031.

SARS-CoV-2 spike glycoprotein vaccine candidate NVX-CoV2373 elicits immunogenicity in baboons and protection in mice.www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.06.29.178509v1

A prefusion SARS-CoV-2 spike RNA vaccine is highly immunogenic and prevents lung infection in non-human primates. bioRxiv, doi:https://doi.org/10.1101/2020.09.08.280818

Adjuvants and the vaccine response to the DS-Cav1-stabilized fusion glycoprotein of respiratory syncytial virus.PLoS ONE 12(10): e0186854.

Structure-Based Design of a Fusion Glycoprotein Vaccine for Respiratory Syncytial Virus.Science 342, 592 (2013);