肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原发性肝癌的主要类型，约占肝癌患者85%-90%。对于早期肝癌，手术切除和肝移植仍是最为有效的治疗手段。然而，由于肝癌早期诊治困难，病情进展快、预后较差，大部分患者确诊时已失去了手术时机。

Case Study
最近，上海交通大学覃文新研究员，荷兰癌症研究所Leila Akkari及René Bernards共同通讯在Nature 发表题为"Inducing and exploiting vulnerabilities for the treatment of liver cancer"的研究论文。该研究通过CRISPR-Cas9基因敲除技术结合高通量化合物筛选，提出先利用肿瘤细胞突变特异诱导肝癌细胞发生衰老、进而清除衰老肿瘤细胞而对正常生长细胞无影响的“One-two punch（组合拳式或分步式）”肝癌精准治疗新策略。

 

细胞分裂是组织发育和维持的一种正常功能。细胞分裂异常，尤其是细胞分裂不受控制，是癌细胞的一个标志性特征。科学家通常非常关注细胞增殖的速度。文中采用Incucyte®实时活细胞成像系统监控癌细胞的健康和活力，同时观察药物处理后，不同细胞系克隆的形成状态。传统的增殖研究方法多为终点法，科学家可能还需要获得准确的细胞计数， Incucyte®不仅可以通过测定汇合度来估计细胞数量，同时还可以利用Nuclight 快速红色试剂获得准确的细胞计数。


CDC7为肝癌衰老诱导策略的靶标

 

利用CRISPR–Cas9基因筛查和慢病毒导向RNA（gRNA）文库，该文库包括Hep3B和Huh7肝癌细胞中的所有人类激酶（图1a）。成功筛选出在肝癌细胞中选择性诱导衰老的多种化合物，XL413是DNA复制激酶CDC7的有效抑制剂，在诱导Hep3B和Huh7细胞中衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal，衰老标记物）方面是这些化合物中最具选择性的（图1b，1c，1d）。这些发现表明， CDC7为肝癌衰老诱导策略的靶标。
 

图1 两步筛选确定CDC7为肝癌衰老诱导策略的靶标


抑制CDC7选择性诱导具有TP53突变的肝癌细胞衰老

利用浓度增加的XL413处理了一组未转化细胞和肝癌细胞系。TP53突变的肝癌细胞系的增殖受损，而野生型TP53（SK-Hep1和Huh6细胞）的肝癌细胞系以及所有四种未转化细胞系对XL413均不敏感，利用Incucyte® 实时活细胞成像系统实时监测不同细胞系的克隆形成（图2），更容易发现TP53突变状态与对CDC7的抑制作用之间的因果关系。XL413的抗增殖作用与TP53突变的肝癌细胞中衰老标记物的诱导有关，但与野生型TP53的肝癌细胞或非转化细胞中的衰老标记物无关，并且在TP53突变的肝癌细胞中，XL413使衰老标记物14富集。同时发现，CDC7的敲除会损害TP53突变的肝癌细胞的增殖和诱导衰老，但对野生型TP53的细胞没有影响。
 

图2 不同细胞系加入浓度增加的XL413后的克隆形成

mTOR抑制剂促进XL413诱导的衰老肝癌细胞的凋亡

为了探索mTOR抑制剂是否可以在XL413诱导衰老模型中用作有效药物，作者分析了mTOR抑制剂（AZD8055）的活性。用XL413处理两种肝癌细胞系10天后，再用浓度增加的mTOR抑制剂处理5~7天，通过Incucyte® 实时活细胞成像系统进行克隆形成实验的监测，发现XL413处理的细胞系加入mTOR抑制剂后，克隆形成率明显降低（图3a）。与此同时，在加入mTOR抑制剂96h后，利用Caspase-3/7处理细胞，进行凋亡实验，通过Incucyte® 实时活细胞成像系统进行实时监测细胞荧光强度的变化，更好地诠释了mTOR抑制剂可显著增加XL413处理的肝癌细胞系的凋亡（图3b）。
 

图3 a. Huh7和Hep3B肝癌细胞系加入浓度增加的XL413和AZD8055后的克隆形成；b. Huh7和Hep3B肝癌细胞系加入浓度增加的XL413和AZD8055后的细胞凋亡


XL413和AZD8005联合使用抑制体内肿瘤生长

为了评估体外发现是否可以在体内重现，研究者制作了Huh7和MHCC97H异种移植物。与载体、AZD8055或XL413和AZD8055组合治疗的肿瘤相比，XL413治疗的肿瘤显示DNA损伤和SA-β-gal+衰老细胞增加对XL413和AZD8005的抑制作用表明CDC7在体内诱导衰老。与索拉非尼治疗相比，XL413和AZD8055联合治疗可更有效地抑制生长，而TP53突变的联合治疗异种移植物显示4EBP1的增殖和磷酸化减少，与凋亡增加相关。

在这种侵袭性肝癌模型中，接受XL413或AZD8055单药治疗的TP53q敲除肿瘤显示出肿瘤体积的适度减少和小鼠寿命的延长，而XL413与AZD8055联合治疗的耐受性良好，与对照组相比，显著降低了肿瘤负担并提高了生存率。重要的是，在联合治疗组中，SA-β-gal阳性和p16（INK4A）阳性细胞的数量减少，这表明通过AZD8055治疗可以有效地消除衰老细胞。

 

Summary
本研究证实，使用CDC7抑制剂的促衰老疗法，结合mTOR抑制剂，可以减轻衰老细胞的细胞自主性和非细胞自主性，从而降低肿瘤复发的风险，从而为肝癌患者带来临床益处。利用诱发的脆弱性可能是治疗肝癌的有效方法。

 

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-参考文献-

【1】Wenxin Qin, Leila Akkari & René Bernards. Inducing and exploiting vulnerabilities for the treatment of liver cancer. Nature. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1607-3