千年之前，文字和纸张的出现带给世界以文明，将思想和经验凝结在方寸之间。然而文化的传播需要更高性价比的技术去实现，古代印刷术应运而生——不仅打破了思想垄断，而且极大地降低了知识信息的存储与传播难度，甚至改变了当时的社会结构。技术发展的重要性由此可见一斑，在现代生物创新药的发展中，高效细胞株开发（CLD）同样离不开一套完整成熟的技术流程。

 

细胞株开发简述：

可靠生产工艺的基础

 

近年来，全球生物医药产业发展正处于快速上升期，医药健康行业也将迎来新一轮的变革与机遇。其中，细胞与基因治疗药物、抗体药物书写创新生物药新篇章，被认为是未来医药领域发展的主力军。但无论是抗体药物的生产还是基于病毒载体的基因治疗药物的制备，都离不开稳定高效的细胞株开发。

 

 

 

▲ Global Market Insights数据预测：CLD市场报告[1]

 

据Global Market Insights数据预测，CLD市场规模在2021年约为58亿美元，预计从2022年到2028年将以每年约10.1%的复合年增长率增长，到2028年将达到约117亿美元。

 

 

CLD作为生物药CMC的起点和基础，构建一个适合于生产的高表达稳定细胞株至关重要，因为其在很大程度上决定了药物开发的效率和成本。

 

CLD与古法造纸过程类似，成本昂贵、耗时长，开发流程如同雕版印刷中的勾刻印绘裱，每个步骤都涉及复杂而精细的生物分析和质量研究工作，并且需要优化的细胞培养工艺，以确保能够成功进行商业生产。

 

在CLD早期工艺开发阶段增强对未来潜在挑战的认识有助于降低失败风险，减少重复工艺相关费用，并确保最终的生物药满足监管要求。目前，CLD面临着一些技术上的关键挑战，例如大批量克隆筛选、早期表征分析和优化以及可扩展性、细胞株稳定性等。

 

面对不同的生物药开发，如何实现高效、高质量的CLD？在工艺上又可以通过哪些手段或方案来满足预期的商业化需求？下面就让小编给大家细细道来。

 

 

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不断优化的技术流程

 

自汉朝发明纸张以后，书写材料比起过去用的甲骨、简牍、金石和缣帛要更轻便、更经济，但流程仍复杂，成本较高，雕版印刷技术的出现改变了这一现状，标准化雕刻了反体字的模板与近乎透明的稿纸正面相贴，大大提升了原始手抄经书的速度，且笔画清晰可辨。

 

目前CLD的标准流程步骤包括：基因克隆和初始克隆筛选、克隆筛选和验证分析、细胞培养及培养基优化、评估和表征分析以及最后的细胞库建立。整个开发周期一般需要12-18个月，对标准化流程中的每一步工艺改进都将影响CLD整体进程。

 

 

▲ 高效细胞株开发工艺流程

 

 

1. 初始克隆筛选——全流程开发的基石

 

雕版印刷术的第一步是选择合适的木板，厚度和硬度都是成功的关键属性，而CLD的第一步需要考虑采用何种表达体系。

 

宿主细胞系直接影响产品的特定属性，比如糖基化、羧基化、羟基化、酰胺化等；甚至还可能影响半衰期、免疫原性和生物学活性。宿主细胞系应有完整表征以及完整的记录，并不含TSE/BSE等病毒污染因f素。另外，宿主细胞还应适合无血清培养基，或者无动物来源成分的培养基中悬浮生长。

 

近年来，随着技术的发展以及研究的深入，有超过75.6%的生物药采用哺乳动物细胞表达体系，其包括人源细胞和非人源细胞，其中在这部分里有超过83%的生物药采用了非人源细胞系的CHO(Chinese hamster ovary)细胞进行CLD。

 

 

 

▲ 2014-2020年获批的生物制剂应用的细胞表达体系比例

 

据统计，在2015年后获批的药物中，CHO细胞表达体系占据超过一半的比例。主要原因有三点：

 

CHO细胞在生物药生产中应用早、表达量高、容易处理和操作以及法规接受程度高；

 

CHO细胞还具有较高的基因和表型不稳定性，有着较多的细胞谱系，例如DG44、DXB11、CHO K1、CHO-S等；

 

致病性的病毒在CHO细胞中无法复制，因此CHO细胞被认为是非常安全的表达体系。

 

此外，初始克隆阶段能够以最快速度鉴定细胞活力，从数以千计的克隆中找到稳定、高产的克隆将为后续流程奠定基础。

 

 

Octet®分子互作分析系统采用生物层干涉（BLI）技术，是一种无标记的、实时监测的技术，主要用于生物分子间相互作用动力学参数及蛋白浓度测定。使用Octet®，能够对纯化的样品和异质的粗样品裂解液中的IgG 浓度进行量化，最多可选96通道，10分钟内检测一块384孔板。

 

 

2. 目标蛋白表达——多方向考量与调整

 

从技术层面上分析，印刷术采用的字模材料主要是木和泥，经过多次使用，排字行距就变得歪斜不整齐。再加上本来字模手工雕刻导致的字体、大小、笔画粗细不一，失误导致的字体颠倒、错字等，因此需要选择合适的墨水和雕刻手法。

 

CLD的开发同样如此，在选择好合适的表达体系后，下一步的关键是让核酸进入细胞并表达目的蛋白——转染。

 

转染是一种重要的重组DNA技术，其可将编码目的蛋白产物基因与表达载体结合并插入细胞基因组。其中，载体是能够自主复制的DNA元件。载体中不仅包含转入的外源基因，还包括一些用于优化蛋白质表达过程和缓解沉默效应的表达元件。选择标记基因的主要目的是加快遗传载体在宿主细胞系中的表达。用于CHO细胞的经典选择标记包括谷氨酰胺合成酶（GS）和二氢叶酸还原酶（DHFR）。

 

 

 

▲ 生物分子的表达载体和转染流程（图片来源：参考资料3）

 

目前转染方法包括基于试剂的方法、基于仪器的方法和病毒介导法：

 

• 基于试剂的方法：基于阳离子脂质的转染、磷酸钙共沉淀、二乙氨基乙基（DEAE）-葡聚糖/聚yi烯亚胺（PEI）/聚合物/树状大分子介导的技术等；

• 基于仪器的方法：电穿孔、微量注射法、激光介导转染、粒子轰击法等；

• 病毒介导法：腺相关病毒、慢病毒等介导的基因递送方法。

   

 

这里，应该注意的是，没有一种方法适用于所有的细胞和实验，在选择转染方法时，需要考虑细胞类型、产品表达量需求、安全性、经济性、工艺放大、周转时间和法规要求等多方面因素。理想的方法应具有高转染效率，低细胞毒性和对正常生理学的影响最小，并且易于使用和具有可重复性等特点。目前常用于哺乳动物细胞转染的方法有磷酸钙法、阳离子脂质体法、病毒转染法和电穿孔法。

 

另外，在转染过程中，化学限定的细胞培养基已经成为当下CHO细胞生产工艺的金标准。

 

 

在有关CHO培养基和克隆筛选方法的对比分析的研究中，研究人员运用培养基基准测试并充分利用Ambr® 15微型生物反应器平台进行克隆/培养基各种组合的培养基筛选，在相同大小、多并行的生物反应器中比较培养物，建立多个实验以评价不同的细胞系或克隆，并研究工艺参数的影响，例如温度、补料、培养基成分、通气量和接种密度。

 

并使用Octet®非标记分子互作分析系统对其进行滴度、结合活性以及糖基化分析等一系列检测。

 

结果显示结果显示，4Cell® XtraCHO培养基，在细胞生长、存活率、产量、糖基化分析方面，性能优于对照组培养基。

 

▲ 试验结果分析数据

 

 

3. 细胞筛选和评估

 

雕版印刷肇始于隋，行于唐世，在不断使用过程中人们逐渐发现其局限性，那就是发现错别字时改起来很困难，常需整块版重新雕刻，因此活字印刷术被发明，大大地加快了精准度和制版时间。现代CLD细胞培养的过程中同样能够通过高通量分析和筛选技术精准、高效地发现目标细胞，并为下游工艺未雨绸缪。

 

通常，细胞转染之后最终的生产克隆中会整合几十到数千个目的基因拷贝，所以很难确定整合的质粒数是否可以达到预期的最佳值。而且，目的基因会选择性标记在宿主细胞基因组中以随机方式进行稳定整合，故无法准确预测整合效果。因此，按照此流程选择的Minipool实际上是异质的混合细胞群体，这些细胞在整合转基因的数量和定位方面可能有明显差异，故细胞比生产率（Qp）也可能各不相同。

 

为了提高高表达细胞出现的概率，可以采用“批量分拣法”富集稳定高产的Minipool。由于早期Minipool的蛋白分泌较少，富集在上清里面的蛋白含量极低，故传统方法在速度及数据准确度上都难以实现。

 

 

iQue®高通量流式细胞仪能够快速监测细胞健康和活力，使用人IgG滴度和活力分析试剂盒可以很好地评估悬浮CHO细胞，同时定量测定其分泌蛋白，以快速识别先导克隆，在短时间内增加克隆评估数量，5分钟内完成一块96孔板检测。

 

ForeCyt®软件上的Panorama功能具有动态多板数据分析能力，包括可以用户自定义标准的图谱，用于检测和识别包含所需IgG同种型抗体浓度和细胞健康的样品，这在多板筛选分析时非常重要。小鼠IgG亚型和产量检测能够简化和加速抗体发现的工作流程，这意味着更短的时间获得更多的分析结果。具体而言，将稳定的Minipool与采用荧光标记的亲和分子或特异性抗IgG抗体一起孵育，以表征细胞表面上分泌的重组蛋白量，从而能够识别和富集高产Minipool。

 

由于监管机构仅接受采用单克隆细胞生产生物药，这意味着生产所用细胞必须是从单个细胞克隆而来的均一细胞，因此需要进一步对Minipool进行单克隆化和选择适于大规模生产的克隆。

 

 

4. 单细胞克隆

 

活字印刷术由于手工制作的原因，单字之间存在个体差异，经过筛选出来的Minipool同样存在这类问题甚至更加严重，可能其中的每个细胞都具有独特的遗传和表型特征。

 

单克隆性不足可能引发一些问题，例如：生长速率、代谢特征、重组蛋白Qp稳定性、产品质量等方面的差异。若Minipool由生长速率（μ）和Qp有微小差异的细胞组成，则μ高的低产Minipool将逐渐在数量上超过μ低的高产细胞群。据报道，这种情况下仅9%的生长优势便足以使细胞在25代内出现过度增殖，这意味着工业生产必需采用基因和表型方面高度均一化的单克隆。

 

因此，需要采用先进的技术手段以该类Minipool的单个细胞为起点进行克隆，以确保生产用的所有细胞均来自单个细胞。对选定的Minipool进行克隆、培养和评估，在多次迭代选择之后，最终的细胞库由具有相同遗传学特征的细胞（克隆群体）组成。目前，常用的细胞单克隆方法包括但不限于以下四种：传统的有限稀释法（LDC）、基于荧光激活细胞分选技术（FACS）、高通量自动化显微技术、自动化克隆系统等。

 

作为LDC或FACS单细胞分选技术的主要替代方法，CellCelector平台可实现高精度、高通量的单细胞及克隆筛选。通过结合高精度的机械臂技术及优化的采集模块，能够自动进行排序及筛选，实现基于图像的单克隆性证明和克隆活力评估，同时准确分离出完整的高活率单细胞、贴壁克隆等，提高CLD效率。

 

此外，因为涉及产品的安全性，细胞的单克隆源性验证在确保生物制药产品的纯度和均一性上至关重要，因此FDA的政策和法规都强制要求生物制药企业提供清晰图片证据，用以证明单克隆生物药研发过程中的单克隆源性。

 

▲ 克隆筛选（图片来源：参考资料5）

 

另外，早期克隆筛选的通量很高，因此必须有一个运行非常平稳和高效的优化过程，包括细胞计数和滴度测定的适当方法，而这些方法都需与高通量兼容。这意味着必须确保筛选了足够数量的克隆，才能得到真正想要的类型。

 

Octet®分子互作分析系统不仅能够快速定量粗提物中的蛋白，而且拥有针对检测ProteinA、HCP残留、唾液酸含量以及甘露糖含量的商业试剂盒，用户可以在早期CLD阶段快速筛选出高质量细胞株，也可以在Octet®系统上轻松开发项目所需的高灵敏度定量分析方法。

 

接下来，完成克隆筛选后，需要进一步验证生物药产品的生物活性、功效及关键质量属性（CQA），这些关键信息将为下一步实验开展及工艺开发提供重要指导。Octet®分子互作分析系统可以进一步对生物药产品的关键质量属性（CQA）进行评价，得到最优单克隆细胞株。

 

 

5. 细胞培养和培养基优化

 

挑选到理想的高表达克隆后，就要开始选择商业化培养基或者定制培养基进行细胞培养优化。高通量、标准化、自动化的细胞培养和工艺优化能帮助我们在获得更准确结果的同时加速细胞株开发进度。

 

另外，在生物药项目开发之初及时采用自动化和高通量平台，还能以可追溯的方式简化优化策略，通过促进多个参数的平行评估，使得从研究规模到商业规模的条件保持一致，显著提高细胞株开发效率。

 

传统的摇瓶培养筛选方法，因为无法提供一个良好稳定的培养环境，导致工艺放大性差，频繁出现错筛和漏筛的情况，最终产生大量无效重复的工作，在一定程度上延长了CLD周期，Ambr®15高通量微型生物反应器系统，采用与玻璃罐反应器相似的物理设计以及配套的数据处理系统，可以高效准确获取克隆的真实性能。

 

 

6. 评估和表征分析

 

在整个生药物开发过程中，应持续对抗体进行表征分析，以确保满足生物安全法规，并确保产品的性能符合预期。

 

Octet®BLI系统作为高通量非标记分子互作平台，不仅可以进行滴度检测，还可以对抗体进行一系列的表征分析，提供详细的表征分析说明书，加快药物申报上市的速度。

 

除此之外，还需对所选细胞进行严格细致的测试，以保证其遗传稳定性，并确保其不含任何病原体及其它未知因子。  

 

 

Summary

 

从雕版到活字，印刷术的发展为CLD流程开发提供了直接的经验性启示。未来仍需要在发展的过程中不断优化CLD的流程。除了采取不同的优化策略，稳定高效的CLD还需要开发更加先进设备。不久前，赛多利斯发布了有关CLD的白皮书，其概述了CLD工艺流程以及生物制药公司在建立CLD流程时面临的关键挑战和优化策略，以帮助有CLD需求的生物制药公司了解更多工艺细节。

 

 

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无论是制造商还是研究机构，从基因克隆到成功商业化，赛多利斯为细胞株开发的每一个关键环节提供灵活的解决方案。

 

 

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-参考文献-

 

https://www.gminsights.com/industry-analysis/cell-line-development-market-report

https://www.researchgate.net/publication/291950333_Challenges_of_glycosylation_analysis_and_control_An_integrated_approach_to_producing_optimal_and_consistent_therapeutic_drugs

https://www.researchgate.net/publication/350861457_Recent_advances_in_CHO_cell_line_development_for_recombinant_protein_production

张爱龙《提升高产细胞株筛选效率，助力基因治疗、抗体药物等工艺开发——单细胞打印机（附案例分享）》

孤毒药师《CMC基石：生物制剂生产中的细胞株开发流程》

Biopharmaceutical Processing: Development, Design, and Implementation of Manufacturing processes. Günter Jagschies, Eva Lindskog, Karol Łącki, Parrish Galliher. 2018