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辉瑞-牛津强强联手：赛多利斯三剑客揭示 USP18 调控之谜
917 人阅读发布时间：2024-06-05 09:22
I型干扰素（IFN）在抗病毒防御相关的细胞免疫调节中发挥着关键作用。I型IFN通过其受体IFNAR1和IFNAR2激活JAK/STAT信号传导途径，进而导致干扰素刺激基因（ISGs）的转录。ISGs参与多种促炎途径，包括趋化因子和细胞因子的加工和呈递，分泌并诱导细胞自主生长停止和死亡。但是为了防止过度炎症导致的自身免疫，I型IFN信号同时诱导负调节物质，如USP18(泛素特异性蛋白酶)和大名鼎鼎的PD-L1。USP18 功能丧失会显著影响免疫调节、病原体易感性和肿瘤生长。USP18具有蛋白水解催化活性，将干扰素诱导的泛素样蛋白ISG15从ISG15偶联蛋白（ISGylated蛋白）中分离出来。
图1. USP18调控ISG15的示意图：USP18通过蛋白酶水解活性调控ISG15的ISGylated
辉瑞和牛津大学的科学家们开发了一系列生化和细胞方法，以系统地定义USP18的生理作用[1]。在这项研究中，他们采用了赛多利斯生物分析的三剑客：CellCelector Flex 全自动无损活细胞分离系统、Octet®非标记分子互作分析系统和Incucyte®实时活细胞成像系统。
细胞系构建
在大部分研究基因功能的实验中，都需要建立基因敲除或者敲入的细胞系。本研究利用辉瑞自创改进的CRISPR方法建立了多个USP18 KO细胞系（人直肠癌细胞系HCT116，HT29；人肺癌细胞系A549，HCC366；小鼠直肠癌细胞系CT26等），使用CellCelector Flex全自动无损细胞分离系统来跟踪细胞系的生长并进行挑取。
CellCelector Flex提供创新高效型单克隆挑取方案 ——基于纳米孔阵列和图像验证的高通量单细胞克隆技术，一轮挑取=单克隆源性验证+克隆生长及健康评估+产率分析，狠狠简化了单克隆筛选流程。
除此之外，Cellcelector Flex还有以下特点
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多达5个荧光通道进行细胞成像，满足14种以上荧光染料
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多种规格毛细管，实现单细胞到细胞团，球体的挑取和分离
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位移精确度≤1μm，确保细胞准确挑取和注射
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温和轻柔的挑取，对细胞无损伤，实现高达95%以上的细胞活率
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使用和维护简单，速度快，通量高
基因编辑后细胞对IFN的敏感性
USP18的主要作用是负调节IFN信号，原则上敲除后USP18后会造成肿瘤细胞增殖对IFN更加敏感。本研究使用Incucyte® 实时活细胞分析系统来追踪和计算细胞的增殖。
图2. 加入IFN的情况下，USP18敲除的细胞系增殖变弱；Incucyte® 每隔4h 拍摄一次，共拍摄120h ，并计算细胞汇合度
除此之外，本研究还使用了Incucyte® 配套细胞凋亡染料Annexin V（绿色荧光）计算细胞活率，结果基本一致。
本研究利用Incucyte® 证实了该细胞系的体外活性，同时用USP18敲除的细胞系嫁接小鼠并形成肿瘤，那么小鼠肿瘤是否对IFN敏感呢？体内结果显示该细胞系嫁接的小鼠肿瘤也对IFN敏感。
图3. 用于嫁接小鼠的肿瘤细胞系CT26体外增殖实验：Incucyte® 计算不同IFN浓度下终点的汇合度，发现mUSP18突变的CT26细胞系对IFN更敏感
类似于USP18，ISG15和其他ISGylated酶级联相关蛋白(比如E1活化酶UBA7)都属于ISGs，同时敲除UBA7和USP18会进一步导致对IFN的敏感度增加吗？
图4. 敲除UBA7/USP18双基因后，与USP18单个基因敲除相比，IFN对细胞增殖的抑制作用无明显差别
Incucyte® 有什么优点呢？
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培养箱内可长达数周的连续观察，减少人力，防止过多操作对细胞的伤害
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多个板位，分别独立设置检测程序，可以兼容各种孔板和培养皿，通量高
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具有划痕、肿瘤球、类器官、趋化、血管生成等多个分析拍摄模块，并配套相应的试剂耗材
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高效简便的模块化软件设置和数据分析，输出图片、视频、生长曲线等多指标多参数，使得结果更加准确
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大于100种优化过的活细胞专用荧光试剂、耗材及详尽的Protocol，文章数大于14000篇；比如本研究使用了Incucyte® 配套细胞凋亡染料Annexin V
ISG15和USP18直接结合测定
ISG15作为USP18的底物，如何更好的证明两者直接结合，进而提供二者之间的亲和力？下面就轮到测定分子水平互作的“神器”Octet®上场了。Octet® 非标记分子互作分析系统测定两者的KD值达到40nM，准确表明了二者有直接结合，而且亲和力很强。
图5. 用Octet® 传感器固化hUSP18，与不同浓度的ISG15进行亲和力测定：左图为ISG15的结合解离曲线，右图为信号浓度依赖曲线
Octet® 优势有哪些呢？
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非标记Direct Binding是趋势，结果更准确
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快速测定亲和力，更加定量化地表征分子互作
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无洗涤步骤，可测弱亲和力，快结合快解离反应
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写入美国药典，文章多达>10,000篇，认可度广
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万金油技术，可以用于检测DNA，小分子，蛋白质等各种生物分子之间的相互作用
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操作简便，耗材及维护成本低
基因功能研究是生命科学基础研究中的核心，而基因编辑的细胞系开发是最重要的工具，细胞水平活性实验是很重要的体外表征手段，而分子水平互作更是揭示机制的重心。赛多利斯生物分析三剑客：CellCelector Flex全自动无损活细胞分离系统、Incucyte® 实时活细胞成像分析系统和Octet® 非标记分子互作分析系统，可以为您大大提高实验效率，节省实验成本，并增加结果的准确性！
-参考文献-
[1] Type I interferon regulation by USP18 is a key vulnerability in cancer.