与靶点蛋白的结合活性分析成为小分子药物开发的关键环节之一。小分子化合物药物与靶点的动力学参数是非常重要的表征参数，直接影响到了化合物在体内的半衰期以及所需的药物剂量。但缺少高通量稳定有效和耐用的生物物理/生化检测方法成为阻碍小分子药物发现和开发的障碍之一。

基于生物层干涉（BLI）技术的Octet检测平台具有高通量、高灵敏度（神药二甲/双胍（129Da）的检测）【1】、对DMSO等有机溶剂不敏感等优点，已经成为小分子药物开发过程中的中坚力量，所以最近有几篇文章用Octet做了海量的小分子数据，陈老湿这里show一下：

 

对比MS、NMR、ITC、紫外吸收、光散射、荧光位置、表面等离子共振SPR、
生物层干涉技术BLI用于与小分子化合物的结合活性分析。【2】
 

ITC技术对样品本量需求大，并且对缓冲液、温度和pH值敏感，因此限制了ITC技术在筛选复杂样品库中的应用。SPR技术虽然已经广泛应用于药物结合活性的分析，但是通量低，微流控的设计使其难以应用于复杂样品库的筛选，芯片与化合物的非特异性问题，小分子化合物的水溶性问题，样品和缓冲液折光率的差异导致的假阳性问题都限制了SPR技术在该领域的应用。因此，研究人员采用成本更低，通量更高，可耐受粗样品的BLI技术检测小分子化合物。

近期就有几篇不错的应用BLI技术开发小分子药物的文章发表，下面就让陈老湿给大家作一个简单的介绍（文末有陈老湿力推的小分子检测“神功宝典”，记得看到最后哦！）。
 

➤ 用Octet建立DNA结合的小分子药物筛选方法
    俄勒冈州立大学【2】

DNA已经成为抗肿瘤药物研究的一个重要的药理学作用靶点。由于DNA的灵活性以及缺少像蛋白质那样的结合位置，且小分子化合物结合后还可能导致DNA空间构象改变，使得开发新的化合物特异性结合靶标DNA具有一定的挑战性。
 

 

首先研究人员选取了6个已经报道的与DNA结合的化合物优化和调整检测方法，检测结果与文献报告结果一致，证明了BLI技术可适合地、可靠地、有效地检测从微生物中提取的复杂组分与DNA的结合。
 

使用Octet检测细菌提取物的技术路线：用Octet固化DNA检测细菌提取物，阳性提取物用HPLC进行分离后再用Octet进行鉴定。

 

随后研究人员筛选了＞100个从微生物中提取的与DNA的结合的化合物，并且得到了几个结合活性较高的化合物，包括棘霉素，放线/菌素等。

ab图：BLI发现从细菌RM1-1的第六个分离组分（放线/菌素）与DNA有结合;
cd图：多浓度的放线/菌素与DNA结合进行鉴定

➤ 新冠肺炎抗病毒药物筛选与验证【3】

新冠病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）是理想的抗病毒靶点。中国医学科学院的研究人员首先通过基于结构的虚拟筛选，筛选了15220个化合物。选择结合最强的50个hits，通过Octet高通量的分析了这些化合物与靶点SARS-CoV-2 RdRp的结合活性。从中挑选结合活性强的化合物进行体外和细胞学实验分析。研究人员发现Corilagin (RAI-S-37)作为SARS-CoV-2 RdRp的非核苷抑制剂，可直接与RdRp结合，在细胞外和细胞活性检测中均能有效抑制聚合酶活性，抑制SARS-CoV-2感染的EC50值为0.13 μmol/L)。Corilagin具有良好的安全性和药代动力学的数据，使其成为新冠肺炎潜在的治疗药物。

Octet筛选与靶点蛋白结合的化合物，用NTA传感器固化SARS-CoV-2 RdRp，与50个化合进行结合(50uM)，
有16个化合物信号大于0.02nm,然后多浓度检测进一步筛选出8个具有浓度依赖信号的化合物。
 

在筛选出的8个化合物中，RAI-S-37与SARS-CoV-2 nsp12的亲和力最高，达到0.54uM

 

➤ 人参活性组分作用靶点研究【4】

人参能够调节大脑兴奋性，促进学习记忆，而人参的主要活性成分是人参皂苷，但是其在大脑中的作用靶蛋白尚未明确。南京中医药大学的研究人员通过亲和层析筛选与人参皂苷主要成分相互作用的蛋白，鉴定出14-3-3 ζ 蛋白为人参皂苷在脑组织中的潜在靶点。通过生物层干涉技术BLI和等温滴定量热法ITC鉴定了20(S)- prototopanaxadiol (PPD，人参皂苷的代谢物)与14-3-3 ζ 蛋白的直接相互作用。14-3-3 ζ 蛋白-PPD复合物的共晶体结构表明，14-3-3 ζ蛋白的R56、R127和Y128残基与部分PPD之间存在主要的相互作用，突变上述任何一个残基都会导致PPD与14-3-3 ζ蛋白的亲和力显著降低。研究结果有助于更好的了解人参调节神经元活性的作用机制以及基于人参皂苷结构开发与14-3-3 ζ 结合的小分子化合物。
 

上图为中药靶点研究的技术路线：BLI（Octet）主要用于鉴定靶点（14-3-3 ζ蛋白）与人参皂苷的结合；
下图：靶点与突变体与人参皂苷的亲和力测定

   

—— 写在最后 ——

作为技术支持的陈老湿来说，小分子的检测还是要说一些丑话，小分子化合物样品难度可比大分子大一些，因为：

1. 分子量较小，信号水平较低，容易收到非特异性等因素干扰 
2. 一些小分子可溶性差，真实浓度与理论浓度可能有差别 
3. 亲和力水平跨度大，检测浓度范围比较宽泛 
4. 可能含有各种有机溶剂，这对Octet和其传感器没有影响，但是可能对蛋白活性有影响  

因此如果检测方法优化不当的话，实验数据的重复性有时不甚理想。

鼓吹“仪器无所不能”之类的大话是没有用的，技术专家同用户分享丰富的经验以及找到切实有效的解决方案才是关键，才能让仪器设备变得“尽善尽美”。

 

最后陈老湿奉上 “神功宝典”一份
《降低小分子筛选及动力学应用的变异性》，
希望各位大侠早日神功大成，记得点击下载哈！

 

-参考文献-

【1】Yaya Zhang, et al. Metformin interacts with AMPK through binding to c subunit. Mol Cell Biochem (2012) 368:69–76.

【2】Overacker, R.D. et al. Biolayer interferometry provides a robust method for detecting DNA binding small molecules in microbial extracts. Anal Bioanal Chem 413, 1159–1171 (2021).

【3】Li Q, et al. Corilagin inhibits SARS-CoV-2 replication bytargeting viral RNA-dependent RNA polymerase, Acta Pharmaceutica Sinica B, 2021.

【4】Feiyan Chen, et al.Identification and confirmation of 14-3-3 ζ as a novel target of ginsenosides in brain tissues,Journal of Ginseng Research,2020,1226-8453.