尽管制药技术已经扩展到细胞疗法、基因疗法、RNA干扰（RNAi）、CRISPR等新型模式，小分子药物仍然是新药研发的一大支柱，除了备受关注的“不可成药”靶点的小分子配体研究，基于表型的药物筛选也随着日益复杂的细胞模型的建立而复兴。提高表型筛选的通量及效率成为加速小分子药物研发的重中之重。

 

表型筛选瓶颈

常用的高内涵成像或免标记筛选方法对于溶液中细胞或者磁珠的检测显得“力不从心”。另外，针对分泌蛋白（包括趋化因子和细胞因子）的多重检测也难以满足所需的高通量和便捷度。

 

iQue® 高通量流式细胞仪通过高通量悬浮细胞筛选填补了这一空白。具备多通道、多参数的特点，可以快速、轻松地筛选 96、384或 1536 孔板的大型文库。通过ForeCyt®高通量分析软件自动生成丰富、海量的数据集，快速确定化合物的优先级，加快推进药物发现流程。下面通过5大应用，一览iQue®在小分子药物研发中的风采吧！

 

 

1. 急性髓系白血病治疗药物开发

 

尽管60%-70%的急性髓系白血病（AML）患者在接受标准诱导治疗后病情得到缓解，但大多数患者会在三年内复发，五年的总生存率只有27%。因此，寻找新的AML治疗策略是一种亟待满足的医疗需求。近期的三项研究中都将iQue®整合到AML潜在治疗药物筛选的工作流程中。

 

蒙特利尔大学免疫学和癌症研究所（IRIC）的科研人员发现Mubritinib（一种ERBB2抑制剂）具有很强的在体外和体内抗AML的活性，可通过抑制泛醌依赖性电子传递链（ETC）复合物I的活性而发挥作用[1]。赫尔辛基大学分子医学研究院的科研人员通过iQue®，同时对34个原始AML样本中不同细胞群对7种药物，及27种组合剂量的体外敏感度进行了评估（图1-1）。结果表明，AML样本中的不同细胞群对靶向治疗药物的敏感度存在差异 [2]。

 

 

图1-1. 实验设置简要流程示意图

 

随后，他们使用iQue®建立了一种高通量流式细胞术，同时监测71种抗肿瘤化合物对多个造血细胞群（表面抗原表达）的剂量反应。通过对比健康细胞和肿瘤细胞（来自AML、多发性骨髓瘤或慢性淋巴细胞白血病患者）的药物反应，发现健康细胞反应能够预测出相应恶性细胞的反应（图1-2）[3]。

 

 

图1-2. iQue®在造血细胞免疫表型分析中的应用及门控策略。使用7-AAD和Annexin-V分别对单核细胞的死细胞和凋亡细胞进行排除。根据其核心表面抗原的表达，检测11个细胞亚群（造血干细胞（HSC/CD34+CD38-），普通祖细胞（CPC/CD34+CD38+）。

 

 

 

2. 小分子化合物库筛选

 

FOXP3+ Treg细胞在控制癌症免疫反应中发挥着重要的作用，但是作为Treg细胞的主要调节因子，FOXP3在诱导的Treg细胞中的表达并不稳定，FOXP3的调控表达及Treg细胞功能的分子靶点也尚不明确。而能够调节FOXP3表达及其下游基因（如CTLA4）的药物靶点具有稳定Treg表型及功能的潜力。来自阿斯利康IMED生物技术部门的研究人员使用iQue®开发了一种自动化384孔板的高通量流式细胞术表型实验，可用于测定人类Treg细胞中FOXP3和CTLA4的蛋白表达[4]（图2）。

 

 

图2. 使用iQue®进行人类Treg细胞扩增、表征和表型筛选。(A）扩增的Treg细胞表达高水平的FOXP3和CTLA4；(B) 扩增的Treg细胞缺乏IL-2的产生；(C, D) 导致FOXP3 MFI增加或减少（C）和导致CTLA4 MFI增加（D）的代表性化合物的柱状图；(E）人类Treg细胞表型筛选简要实验流程，包括Treg细胞的分离、扩增、小分子化合物处理以及细胞活力、FOXP3和CTLA4表达。

 

 

 

3. 蛋白激酶抑制剂化合物库筛选

 

北卡罗来纳大学药理学院的研究人员使用iQue®筛选出了一个包含800多种蛋白激酶抑制剂的化合物库，并确定了可在KRAS突变型胰腺导管腺癌（PDAC）细胞系中促进MYC癌蛋白稳定或降解的化合物[5]（图3）。由于KRAS信号使MYC变得稳定，进而促进PDAC的生长，因此深入了解这种稳定性的调节方式将有助于开发出治疗极具挑战性癌症的疗法。

 

 

图3. MYC降解筛选优化。(A）GPS-MYC筛选示意图。(B）GPS-MYC细胞用vehicle（DMSO）单一处理，或用MG132或CHX处理6小时，并在iQue®上进行分析。数据来自于每个对照组的前两孔和后两孔，分别代表实验开始（0分钟）和结束（45分钟）。(C) GPS-MYC筛查是一式两份的。数据与对照组DMSO（蓝色圆圈，0%稳定）和MG132（绿色圆圈，100%稳定）进行归一化处理，并以两个重复的30%平均稳定率为界确定命中率。代表命中的圆圈以紫色显示。圆圈的大小与每孔的事件数成正比。评估出的稳定化化合物在图中标出。(D) 与(C)相同，除了对照组为DMSO（蓝色圆圈，0%失稳）和CHX（红色圆圈，100%失稳）。评估出的不稳定化合物被标出。

 

 

 

4. 揭示小分子BH3模拟物抗癌机制

 

抑制癌细胞的抗凋亡机制也是一种极具前景的治疗方法。小分子BH3模拟物能够模拟BH3蛋白，抑制抗凋亡蛋白促细胞生存的功能，从而诱导癌细胞凋亡。要成为真正的BH3模拟物，就必须满足2个标准：

 

1）需要直接在已知抗凋亡依赖性细胞的线粒体上发挥作用；

 

2）直接且选择性抑制具有高亲和力的抗凋亡蛋白。

 

来自美国丹娜法伯肿瘤医院的科研人员开发了一套能够综合分析BH3模拟候选物，并进行高通量活性测试的方法。iQue®在此方法主要用于进行活性测试[6]。

 

 

 

5. 确定去铁酮（DFP）的抗增殖机制

 

近期，佐治亚理工学院的一项研究中使用iQue®确定去铁酮（DFP）的抗增殖机制[7]。DFP是2011年由FDA批准在美国上市的一种可口服的铁螯合剂，与铁具有良好的亲和力，可有效地控制体内铁负荷。研究人员发现，DFP的抗增殖活性主要来自其对铁依赖组蛋白赖氨酸脱甲基酶（KDM）亚群的抑制。他们还发现了基于DFP的新型KDM抑制剂，该抑制剂对癌细胞系的细胞毒性更强。在小鼠异种移植模型中，仅一种先导化合物就能有效抑制乳腺肿瘤的生长。在该研究中，所有基于流式细胞术的测试均由iQue®完成。

 

 

 

为什么iQue®在小分子药物开发中被广泛认可？

 

更快的高通量筛选：96孔板分析仅需5分钟，384孔板分析仅需20分钟；

 

节约成本，加快研发速度：每个孔中采样 1 µL，节省了试剂成本，保存了有限的样本；

 

为悬浮细胞的高通量筛选赋能：对免疫调节剂或复杂的混合细胞（如 PBMC）的分析进行优化，并以单细胞的分辨率生成每种细胞类型的数据；

 

智能的数据分析处理：ForeCyt®软件是基于微孔板整板分析的大型数据集，包括内置标准曲线和独特功能（如 Profile Map）的数据分析和可视化工具，数据可轻松导出到您的电子实验室笔记本系统

 

 

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-参考文献- 

 

1. Baccelli I, Gareau Y, Lehnertz B, et al. Mubritinib as a strong in vitro and in vivo anti-leukemic compound, acting through ubiquinone-dependent inhibition of electron transport chain complex I (ETC1). http://dx.doi. org/10.1101/513887

 

2. Kuusanmäki H, Leppä A-M, Pölönen P, et al. Phenotypebased drug screening reveals association between venetoclax response and differentiation stage in acute myeloid leukemia. Haematologica. 2020:105(3):708-720. doi: 10.3324/haematol.2018.214882.

 

3. ntasir MM, Leppä A-M, Hellesoy M, et al. Multiparametric single cell evaluation defines distinct drug responses in healthy hematological cells that are retained in corresponding malignant cell types. Haematologica. 2020;105(6):1527-1538. doi:10.3324/haematol.2019.217414.

 

4. Ding M, Brengdahl J, Lindqvist M, et al. A Phenotypic Screening Approach Using Human Treg Cells Identified Regulators of Forkhead Box p3 Expression. ACS Chem Biol. 2019;14(3):543-553. doi: 10.1021/acschembio.9b00075. Epub 2019 Mar 4. PMID: 30807094

 

5. Blake, DR, Vaseva AV, Hodge RG, et al. Application of a MYC degradation screen identifies sensitivity to CDK9 inhibitors in KRAS-mutant pancreatic cancer. Sci Signal. 2019;12(590):eaav7259. Doi: 10.1126/scisignal.aav7259.

 

6. Villalobos-Ortiz M, Ryan J, Mashaka TN, et al. BH3 profiling discriminates on-target small molecule BH3 mimetics from putative mimetics. Cell Death Differ. 2020;27(3):999-1007. doi:10.1038/s41418-019-0391-9.

 

7. Khodaverdian V, Tapadar S, MacDonald IA, et al. Deferiprone: pan-selective histone lysine demethylase inhibition activity and structure activity relationship study. Sci Rep. 2019;9(1):4802. doi:10.1038/s41598-019-39214-1.