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《Compromised Humoral Functional Evolution Tracks with SARS-CoV-2 Mortality》，
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Cell发表新冠免疫研究新进展，高通量流式技术强助力
人阅读 发布时间：2021-05-07 14:59
2020年11月Cell上发表了一篇新冠病毒研究文章，题为《Compromised Humoral Functional Evolution Tracks with SARS-CoV-2 Mortality》，来自麻省总医院（MGH）、麻省理工学院（MIT）和哈佛大学的Ragon研究所等研究人员，揭示了SARS-CoV-2死亡率相关的体液免疫应答。
文章指出，对于新冠病毒的疫苗开发，目前仍然缺乏明确的免疫相关性研究支持。在其他病原体感染中，中和作用能产生保护作用，但不清楚在更为广泛的人群中，只靠中和作用是否足以对抗SARS-CoV-2产生保护作用。因此，为了充分定义保护性体液免疫，研究人员分析了193名中重度住院患者体液反应的早期演变。
下面小编就带大家看看这项研究是如何进行的。
图1：本文图解摘要，来自Cell
● 193名住院患者分为三组，在感染出现症状后1个月内采样1-8次，共计392份血浆样本（如图A所示）：
○ 中度感染后痊愈的住院病人，共82例，采集血浆样本累计122份
○ 重度感染后痊愈的住院病人，共76例，采集血浆样本累计196份
○ 重度感染死亡的住院病人，共35例，采集血浆样本累计74份
对这193名SARS-CoV-2感染患者的392份血浆样本进行5种免疫球蛋白定量分析。在该检测中采用的是基于微球的蛋白定量法，结合iQue高通量流式细胞技术实现快速、高通量检测和自动定量分析。具体来说，首先将感兴趣的目的抗原（S蛋白）与荧光标记的微球进行共价结合，然后将偶联抗原的微球进行清洗和阻断，之后加入适当稀释的病人血浆样本，孵育一定时间后清洗，最后加入另一种荧光标记的检测抗体，最后用iQue 高通量流式细胞仪采集血浆样本，用Forecyte软件分析数据获得抗原特异性抗体的每个亚类和同型（IgG1、IgG3、IgA1、IgA2和IgM）的滴度数据。
图2：在不同临床病程中，SARS-CoV-2特异性体液免疫反应的每周演变。来自Cell原文。
● 检测结果发现（如图B所示）：
○ 症状出现1周内，三组患者均观察到类似的SARS-CoV-2抗原特异性IgM和IgA滴度，严重疾病幸存者的特异性IgA1滴度略高。同样，IgG3滴度也未观察到明显的组间差异。然而，抗S特异性IgG1滴度在中度和重症患者间有显著差异，而且重症死亡病人的IgG1滴度更低。
○ 到第2周时，与中度疾病患者和死亡患者相比，在重症患者中观察到几乎所有S蛋白特异性抗体同型和亚类的滴度显著升高，所有抗原的滴度也显著升高。在死亡患者和中度疾病的患者中，S特异性IgG1滴度增高较慢。
○ 到第3周，所有组的IgA和IgM水平几乎相当。然而，与死亡组相比，患有中重度疾病的幸存个体在第三周都产生了更高的IgG亚类滴度，这表明在幸存者中IgG免疫力发展是一致的，而在非幸存者中则是延迟和受损的。
因此，尽管非幸存者在早期都产生了有力的IgG抗体和IgM抗体，但其IgG发展存在潜在的选择性缺陷，与COVID-19死亡率相关。
事实上，研究人员不仅分析了针对S蛋白的特异性抗体免疫反应变化。作者在补充数据中还展示了这些患者血浆中针对RBD、N、S1 trimer、S1、S2蛋白的特异性抗体各种亚型（IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgM）在出现症状后1周、2周和3周以上的动态发展变化。
图3：出现症状后每周抗体的演变。来自Cell原文。
小编初略一算，392份样本，6种目的蛋白，5种抗体亚型，每个样本要获得30个读数，共计11,760个数据点，这么高的通量，无怪乎研究人员选择iQue——在最快的时间内，从少量的珍贵样本中获得尽可能多的信息，加快新冠研究进程！
随后，考虑到IgG类别转化的差异，研究人员还检测了这种受损的类别转化带来的功能性结果，如SARS-CoV-2特异性抗体与低亲和力IgG-Fcɣ受体（FcɣRs）和IgA-Fc -α受体（FcαR）结合的能力（结果如图C所示），这对引起抗体效应功能至关重要，以及抗体介导的固有免疫效应功能，如抗体依赖的细胞吞噬（ADCP）、抗体依赖的中性粒细胞吞噬（ADNP）和抗体依赖的补体沉积（ADCD）效应（结果如图D所示）。所有流式检测均在iQue高通量流式细胞仪上完成。
为了进一步研究在SARS-CoV-2感染后重症存活或未存活的个体之间，特异性抗体特性或抗原特异性是否存在差异，研究人员基于上述所有分析指标（抗体滴度、与不同IgG受体结合水平，及抗体介导的各种固有免疫效应）生成了极坐标图（polar plot）来分析症状出现后1、2和3周体液免疫特征的潜在模式。
图4：体液免疫架构的每周演变。来自Cell原文。
如上图所示，早在出现症状后的第一周，重症存活患者中即观察到体液免疫增强。虽然两组患者的反应总体上都有所增强，但存活患者的反应比未存活患者的上升更为一致和强劲。虽然两组的IgA、IgM反应类似，但总体而言，未存活患者组的IgG3水平、FcR结合和Fc功能呈现减弱趋势。这在症状出现后第二周后可观察到，在第三周这种趋势进一步放大，与之前单变量分析中观察的结果类似。尤其是，幸存者表现出整体较高的吞噬反应。为了阐明不同组间体液免疫应答的总体差异，每类特性单变量差异的非参数组合揭示，与死亡患者相比，重症幸存患者的FcR结合水平早在症状出现后一周总体显著增高，Fc功能性反应在第3周增高。这些数据突出了与COVID-19死亡率相关的体液免疫反应缺陷。
文章指出，对于新冠病毒的疫苗开发，目前仍然缺乏明确的免疫相关性研究支持。在其他病原体感染中，中和作用能产生保护作用，但不清楚在更为广泛的人群中，只靠中和作用是否足以对抗SARS-CoV-2产生保护作用。因此，为了充分定义保护性体液免疫，研究人员分析了193名中重度住院患者体液反应的早期演变。
iQue
在本项研究中，研究人员采用iQue高通量流式细胞平台，结合基于微球的蛋白定量方法，对大批量的患者血浆样本中的免疫球蛋白（IgG1、IgG3、IgM、IgA1和IgA2）进行快速高通量检测和定量分析。下面小编就带大家看看这项研究是如何进行的。
图1：本文图解摘要，来自Cell
○ 中度感染后痊愈的住院病人，共82例，采集血浆样本累计122份
○ 重度感染后痊愈的住院病人，共76例，采集血浆样本累计196份
○ 重度感染死亡的住院病人，共35例，采集血浆样本累计74份
对这193名SARS-CoV-2感染患者的392份血浆样本进行5种免疫球蛋白定量分析。在该检测中采用的是基于微球的蛋白定量法，结合iQue高通量流式细胞技术实现快速、高通量检测和自动定量分析。具体来说，首先将感兴趣的目的抗原（S蛋白）与荧光标记的微球进行共价结合，然后将偶联抗原的微球进行清洗和阻断，之后加入适当稀释的病人血浆样本，孵育一定时间后清洗，最后加入另一种荧光标记的检测抗体，最后用iQue 高通量流式细胞仪采集血浆样本，用Forecyte软件分析数据获得抗原特异性抗体的每个亚类和同型（IgG1、IgG3、IgA1、IgA2和IgM）的滴度数据。
图2：在不同临床病程中，SARS-CoV-2特异性体液免疫反应的每周演变。来自Cell原文。
○ 症状出现1周内，三组患者均观察到类似的SARS-CoV-2抗原特异性IgM和IgA滴度，严重疾病幸存者的特异性IgA1滴度略高。同样，IgG3滴度也未观察到明显的组间差异。然而，抗S特异性IgG1滴度在中度和重症患者间有显著差异，而且重症死亡病人的IgG1滴度更低。
○ 到第2周时，与中度疾病患者和死亡患者相比，在重症患者中观察到几乎所有S蛋白特异性抗体同型和亚类的滴度显著升高，所有抗原的滴度也显著升高。在死亡患者和中度疾病的患者中，S特异性IgG1滴度增高较慢。
○ 到第3周，所有组的IgA和IgM水平几乎相当。然而，与死亡组相比，患有中重度疾病的幸存个体在第三周都产生了更高的IgG亚类滴度，这表明在幸存者中IgG免疫力发展是一致的，而在非幸存者中则是延迟和受损的。
因此，尽管非幸存者在早期都产生了有力的IgG抗体和IgM抗体，但其IgG发展存在潜在的选择性缺陷，与COVID-19死亡率相关。
事实上，研究人员不仅分析了针对S蛋白的特异性抗体免疫反应变化。作者在补充数据中还展示了这些患者血浆中针对RBD、N、S1 trimer、S1、S2蛋白的特异性抗体各种亚型（IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgM）在出现症状后1周、2周和3周以上的动态发展变化。
图3：出现症状后每周抗体的演变。来自Cell原文。
小编初略一算，392份样本，6种目的蛋白，5种抗体亚型，每个样本要获得30个读数，共计11,760个数据点，这么高的通量，无怪乎研究人员选择iQue——在最快的时间内，从少量的珍贵样本中获得尽可能多的信息，加快新冠研究进程！
随后，考虑到IgG类别转化的差异，研究人员还检测了这种受损的类别转化带来的功能性结果，如SARS-CoV-2特异性抗体与低亲和力IgG-Fcɣ受体（FcɣRs）和IgA-Fc -α受体（FcαR）结合的能力（结果如图C所示），这对引起抗体效应功能至关重要，以及抗体介导的固有免疫效应功能，如抗体依赖的细胞吞噬（ADCP）、抗体依赖的中性粒细胞吞噬（ADNP）和抗体依赖的补体沉积（ADCD）效应（结果如图D所示）。所有流式检测均在iQue高通量流式细胞仪上完成。
为了进一步研究在SARS-CoV-2感染后重症存活或未存活的个体之间，特异性抗体特性或抗原特异性是否存在差异，研究人员基于上述所有分析指标（抗体滴度、与不同IgG受体结合水平，及抗体介导的各种固有免疫效应）生成了极坐标图（polar plot）来分析症状出现后1、2和3周体液免疫特征的潜在模式。
图4：体液免疫架构的每周演变。来自Cell原文。
如上图所示，早在出现症状后的第一周，重症存活患者中即观察到体液免疫增强。虽然两组患者的反应总体上都有所增强，但存活患者的反应比未存活患者的上升更为一致和强劲。虽然两组的IgA、IgM反应类似，但总体而言，未存活患者组的IgG3水平、FcR结合和Fc功能呈现减弱趋势。这在症状出现后第二周后可观察到，在第三周这种趋势进一步放大，与之前单变量分析中观察的结果类似。尤其是，幸存者表现出整体较高的吞噬反应。为了阐明不同组间体液免疫应答的总体差异，每类特性单变量差异的非参数组合揭示，与死亡患者相比，重症幸存患者的FcR结合水平早在症状出现后一周总体显著增高，Fc功能性反应在第3周增高。这些数据突出了与COVID-19死亡率相关的体液免疫反应缺陷。
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